靶向DNA甲基化的原則

　　建立靈活的靶向測(cè)序技術(shù)用于靶基因/CpG位點(diǎn)檢測(cè)。易建立靶向DNA甲基化高通量測(cè)序(Target-BS)是針對(duì)現(xiàn)有的靶基因面板組合，利用易基因自主研發(fā)的特異性多重PCR引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的靶基因進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，數(shù)據(jù)庫(kù)建立后，可準(zhǔn)確檢測(cè)高深度(1000倍以上)。

　　靶向DNA甲基化是DNA化學(xué)修飾的一種形式，可以在不改變DNA序列的情況下改變基因表達(dá)。所謂就是在轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶5號(hào)碳位是與甲基共價(jià)結(jié)合。大量研究表明，可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性和DNA相互作用的改變蛋白質(zhì)改變以控制基因。

　　靶向DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)至早、研究至多的遺傳調(diào)控機(jī)制之一。廣義上是指在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以DNA序列為基礎(chǔ)，利用S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體通過(guò)共價(jià)鍵合獲得甲基的化學(xué)修飾。修飾可以發(fā)生在C-5位、腺嘌呤的N-6位和鳥嘌呤的G-7位。一般研究涉及的主要是指發(fā)生在CpG二核苷酸第5個(gè)碳原子上的，及其產(chǎn)物被稱為5-甲基(5-mC)，是動(dòng)植物等真核生物的主要形式，也是目前發(fā)現(xiàn)的形式哺乳動(dòng)物DNA。作為一種相對(duì)穩(wěn)定的修飾狀態(tài)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，隨著DNA后代的遺傳給新生兒DNA是一個(gè)重要的遺傳機(jī)制。

　　CMTs酶只存在于植物，主要特點(diǎn)是其催化區(qū)域T和IV嵌入染色體的主要區(qū)域，并特異性維持CG胞嘧啶的。Dnmt：在小鼠、人類和斑馬魚鑒定出的第3類酶。Dnmt3a和Dnmt3b在未分化的胚胎干細(xì)胞高表達(dá)，他們的主要作用是從頭開始，但他們也起到維持作用，并負(fù)責(zé)重復(fù)序列。

　　與傳統(tǒng)的BSP克隆測(cè)序相比，超深度亞硫酸鹽甲基化測(cè)序具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中小于1%的水平。

　　1.樣品需求低，20ng基因組DNA即可實(shí)現(xiàn)多基因擴(kuò)增;

　　2.適用范圍廣，適用于基因組DNA、FFPE樣本、游離cfDNA等樣本;

　　3.檢測(cè)成本明顯低于現(xiàn)有技術(shù)，檢測(cè)成本快速且經(jīng)濟(jì)。

　　液相色譜(LC)是一種泛基因組DNA甲基化平臺(tái)，用于定量樣品中總5-甲基脫氧胞苷(5mdC)含量。基本上，脫氧核糖核酸酶、堿性磷酸酶和核酸外切酶依次或同時(shí)水解DNA樣品。層析分離后，表示為5mdC和5mdC加脫氧胞苷(dC)之和的百分比。LC分析可以快速獲得并量化實(shí)驗(yàn)的整體甲基化水平，但很難建立適合5mdC和dC的內(nèi)標(biāo)?；贚C分析的技術(shù)難點(diǎn)在于獲取甲基化位置的詳細(xì)信息。色譜技術(shù)仍然有效，當(dāng)與熒光、紫外和質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，可以提高靈敏度。在這些改進(jìn)中，LC/MS為整個(gè)基因組DNA甲基化的定量提供了一種準(zhǔn)確且高度靈敏的方法。