（1）dnmt1介導(dǎo)的5mC維持是染色體發(fā)生和受精所必需的

為了研究德國(guó)小蠊5mC修飾與雌性生殖的關(guān)系，研究人員首先分析了德國(guó)小蠊雌性成蟲體內(nèi)5mC修飾的時(shí)空分布。在6個(gè)組織中，與頭、腿和中腸相比，卵巢、胸腔和被膜中的5mC含量更高。隨后，研究人員還分析了整個(gè)第一生殖期(8天)卵巢內(nèi)5mC的分布。結(jié)果表明，從第1天到第4天（成蟲羽化期（PAE））呈下降趨勢(shì)，隨后增加，直到產(chǎn)卵。qRT-PCR結(jié)果表明，第一個(gè)性腺周期卵巢中Dnmt1的表達(dá)水平與基因組5mC趨勢(shì)一致，即 DNMT1誘導(dǎo)的卵巢5mC維持可能在雌性生殖中起關(guān)鍵作用。

研究人員進(jìn)一步在雌性成蟲中RNA干擾(RNAi)實(shí)驗(yàn)，dsRNA被設(shè)計(jì)為靶向Dnmt1。dsDnmt1處理后基因表達(dá)顯著降低，5mC水平也顯著降低。dsDnmt1組卵囊全部萎縮、干癟，卵囊內(nèi)的卵全部不能孵化。原核染色的結(jié)果表明，在ds CK處理的卵子中發(fā)現(xiàn)了來自卵子的雌性原核和來自精子的雄性原核，而在ds Dnmt1處理或未交配的卵子中未檢測(cè)到雄性原核。在dsDnmt1處理過的昆蟲中，海綿體嚴(yán)重畸形。這些結(jié)果表明dsDnmt1誘導(dǎo)的海綿體畸形破壞了受精，并進(jìn)一步終止了胚胎發(fā)生。在dsDnmt1處理后的第7天(卵黃形成階段)，卵巢卵泡細(xì)胞沒有表現(xiàn)出任何明顯的影響。然而，在PAE第9天(絨毛膜形成階段)，dsDnmt1處理的卵巢中卵泡細(xì)胞核顯示不規(guī)則和凝聚的形狀，這些卵泡細(xì)胞顯示細(xì)胞骨架解體的跡象。這些發(fā)現(xiàn)表明dnmt1介導(dǎo)的5mC維持對(duì)德國(guó)蜚蠊的及時(shí)絨毛膜形成和正常受精至關(guān)重要。

圖1 Dnmt1介導(dǎo)的5mC維持是絨毛膜形成和受精不可缺少的

(2)低甲基化誘導(dǎo)的過量20E損害絨毛膜的發(fā)生和受精

考慮到dsDnmt1在PAE第7天和第9天誘導(dǎo)的不同現(xiàn)象，研究人員在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)dsCK和dsDnmt1的卵巢進(jìn)行了RNA-Seq檢測(cè)。主成分分析(PCA)和差異基因火山圖都表明，在dsCK組中，第7天和第9天的轉(zhuǎn)錄組有顯著差異；然而，dsDnmt1組在第7天和第9天的轉(zhuǎn)錄組與dsCK組在第7天的轉(zhuǎn)錄組非常相似。這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化與兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到的形態(tài)學(xué)變化一致，即dsDnmt1處理在第7天沒有顯著影響，但延遲了第9天的發(fā)育進(jìn)展。

為了研究dsDnmt1對(duì)絨毛膜發(fā)生的影響，作者分析了PAE第9天上調(diào)的DEG，并檢測(cè)了它們?cè)贙EGG通路中的富集情況。幾種營(yíng)養(yǎng)相關(guān)通路和昆蟲激素生物合成通路被激活和富集，這意味著營(yíng)養(yǎng)或/和激素可能參與了DNMT1調(diào)控的絨毛膜發(fā)生。卵巢被報(bào)道是成年女性激素生成和循環(huán)20E的主要來源。研究人員觀察到dsDnmt1組在PAE第9天卵巢中20E水平增加了3倍。為了證實(shí)20E對(duì)絨毛膜發(fā)生的影響，作者將低劑量的20E注射到雌性成蟲體內(nèi)，結(jié)果表明，大多數(shù)經(jīng)20E處理的卵囊萎縮和干枯，其中大部分卵未能孵化?？傊?，dsDnmt1在絨毛膜形成和受精過程中誘導(dǎo)的表型缺陷應(yīng)部分歸因于絨毛膜形成過程中20E水平的異常升高。

圖2低甲基化誘導(dǎo)的過量20E損害絨毛膜的發(fā)生和受精

(3)低甲基化增加和延長(zhǎng)的ftz-f1表達(dá)會(huì)導(dǎo)致過度的類固醇生成

為了揭示差異基因表達(dá)與5mC修飾之間的聯(lián)系，研究人員利用WGBS，分析了dsDnmt1組和dsCK組在PAE第9天卵巢中5mC水平的差異。在dsDnmt1處理過的昆蟲卵巢中，CpG位點(diǎn)的全基因組甲基化水平從15%下降到6%。與dsCK組相比，dsDnmt1組中99.97%的差異甲基化區(qū)(DMRs)為低甲基化DMRs，僅發(fā)現(xiàn)0.03%的高甲基化DMRs。

隨后，作者探究了dsDnmt1處理昆蟲在PAE第9天卵巢中甾體生成變化與5mC水平變化之間的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)，在dsDnmt1組中直接參與類固醇生成的DEGs中，ftz-f1顯著上調(diào),并且上游 2kb啟動(dòng)子區(qū)域顯著發(fā)生低甲基化，即Dnmt1可能通過維持ftz-f1啟動(dòng)子區(qū)域的5mC水平來抑制甾體生成。研究人員進(jìn)一步對(duì)dsDnmt1/dsCK中413個(gè)低甲基化和上調(diào)基因進(jìn)行了分析，篩選出8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TF)基因。然后分別敲除前6個(gè)TF基因，發(fā)現(xiàn)只有dsftz-f1處理顯著降低了phm(phantom)的表達(dá)。敲除ftz-f1也導(dǎo)致EcR表達(dá)顯著降低。此外，敲除phm、ftz-f1、EcR或taiman (tai, EcR的共激活劑)可顯著降低20E水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)TZ-F1可能不僅作為促進(jìn)甾體生成的轉(zhuǎn)錄因子，而且作為與Tai一起增強(qiáng)20E信號(hào)通路EcR活性的能力因子?？傊?，作者得出結(jié)論，dsDnmt1引起的低甲基化增加并延長(zhǎng)了ftz-f1的表達(dá)，導(dǎo)致過度的類固醇生成。

圖3低甲基化誘導(dǎo)的ftz-f1過表達(dá)調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞的卵狀細(xì)胞形成

(4) ftz-f1啟動(dòng)子通過5mC修飾以防止ftz-f1的表達(dá)

研究人員進(jìn)一步研究了dsDnmt1誘導(dǎo)的低甲基化與第9天PAE時(shí)ftz-f1表達(dá)延長(zhǎng)之間的潛在聯(lián)系。WGBS數(shù)據(jù)表明，在dsDnmt1組中觀察到ftz-f1啟動(dòng)子區(qū)域中5mC水平急劇下降。此外，下一代亞硫酸鹽測(cè)序PCR (NGS-BSP)的結(jié)果也表明，在ftz-f1啟動(dòng)子區(qū)域的6個(gè)擴(kuò)增子(~7kb)中觀察到5mC水平急劇下降。作者進(jìn)一步使用NGS-BSP和RNA-seq評(píng)估了第一個(gè)性腺周期中ftz-f1啟動(dòng)子中5mC和表達(dá)水平的變化趨勢(shì)。對(duì)相同的6個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行分析，從PAE第1-3天到PAE第4-6天，擴(kuò)增子3和5有明顯的下降趨勢(shì)，隨后增加直到產(chǎn)卵。并且，ftz-f1的表達(dá)一直保持在低水平直到PAE第6天，在卵黃發(fā)生結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值(第7天)，然后在絨毛膜發(fā)生期間下降?？偟膩碚f，ftz-f1這兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域的5mC水平與ftz-f1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明ftz-f1啟動(dòng)子通過Dnmt1介導(dǎo)的5mC修飾來阻止ftz-f1表達(dá)的延長(zhǎng)。

圖4 ftz-f1啟動(dòng)子通過5mC修飾抑制ftz-f1延長(zhǎng)表達(dá)

（5）dsDnmt1誘導(dǎo)的缺陷部分被ftz-f1挽救

為了證實(shí)Dnmt1對(duì)ftz-f1表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用，研究人員同時(shí)進(jìn)行了dsDnmt1和dsftz-f1處理。與dsftz-f1共處理可減弱dsnmt1誘導(dǎo)的ftz-f1上調(diào)，dsDnmt1誘導(dǎo)的過量20E水平也被dsftz-f1的共同處理部分抵消。由于dsftz-f1處理可以完全破壞產(chǎn)卵過程，因此與dsDnmt1共處理使產(chǎn)卵率恢復(fù)到較高水平。此外，作者還關(guān)注了濾泡細(xì)胞和海綿體上明顯的表型缺陷。dsDnmt1與dsftz-f1共處理部分挽救了dsDnmt1誘導(dǎo)的卵泡細(xì)胞解體和海綿體畸形形成。dsDnmt1和dsftz-f1共處理的結(jié)果進(jìn)一步表明，dnmt1在ftz-f1啟動(dòng)子區(qū)域維持5mC水平抑制了ftz-f1的表達(dá)，dsDnmt1-增加和延長(zhǎng)的ftz-f1表達(dá)破壞了絨毛膜的發(fā)生和受精。

圖5在絨毛膜發(fā)生過程中，ftz-f1基因的敲除可以部分挽救dsDnmt1誘導(dǎo)的現(xiàn)象

（6）5mC修飾可阻止ftz-f1誘導(dǎo)的Mmp1表達(dá)和突變

已有研究表明，F(xiàn)TZ-F1誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶 (Mmp)基因的表達(dá)，從而調(diào)控果蠅卵巢卵泡細(xì)胞的成熟和破裂。與這一調(diào)控機(jī)制一致，Mmp1在dsDnmt1處理的卵巢中上調(diào)，并被dsDnmt1和dsftz-f1雙RNAi挽救。當(dāng)ftz-f1被敲除時(shí)，卵巢中Mmp1的表達(dá)也顯著下調(diào)。此外，作者還研究了5個(gè)已知的絨毛膜基因在轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá), 其中3個(gè)在dsDnmt1組的PAE第9天顯著下調(diào)。總的來說，低甲基化增加和延長(zhǎng)的ftz-f1表達(dá)導(dǎo)致卵泡細(xì)胞解離和失活，這可能導(dǎo)致無法合成足夠的絨毛膜蛋白，進(jìn)一步破壞受精。

圖6 5mC修飾可防止絨毛發(fā)生過程中ftz-f1誘導(dǎo)的失活