在小鼠的早期胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基轉移酶蛋白（DNMT1）和雙加氧酶家族蛋白（TET）家族會動態(tài)調控DNA胞嘧啶上第五個碳原子的甲基化（5mC）。隨著受精的進行，精子和卵子中攜帶的配子源的5mC會逐漸被去除，直到囊胚階段達到最低點。在著床后，DNMT3A和DNMT3B介導的重頭甲基化作用下，DNA甲基化水平達到成年水平，并且DNMT1維持DNA甲基化的功能使胚胎在細胞分裂的過程中保持高度DNA甲基化的狀態(tài)。已有研究表明，敲除TET家族蛋白（TET1/2/3）會導致小鼠原腸運動失敗，而Dnmt1或Dnmt3a/3b突變體的小鼠胚胎則可能在發(fā)育中期（E9.5）發(fā)生胚胎致死現(xiàn)象。盡管已經(jīng)產(chǎn)生了缺乏DNA甲基化的小鼠胚胎干細胞和滋養(yǎng)層干細胞系，這些細胞仍然展示出正常的自我更新能力。然而，目前尚未構建出DNA甲基化完全缺失的胚胎，這使得早期胚胎發(fā)育的功能和機制仍未被完全闡釋。

2023年5月22日，中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心李勁松研究團隊、徐國良研究團隊、吳立剛研究團隊、以及北京大學湯富酬研究團隊共同通訊在Nature Communications發(fā)表題目為“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”的研究論文。該研究通過篩選可以有效引入終止密碼子的堿基編輯器，建立了受精卵中多個內源基因同時失活的系統(tǒng)，揭示了啟動子甲基化與抑制miRNA表達之間的表觀遺傳相關性。

英文標題：Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation

中文標題：堿基編輯介導一步失活Dnmt基因家族揭示DNA甲基化在小鼠原腸形成期間的重要作用

發(fā)表時間：2023年5月22日

發(fā)表期刊：Nature Communications (IF = 17.6 / SCI一區(qū))

技術方案：WGBS、RNA-seq、CAS-seq等

該研究建立了小鼠受精卵中基于高效胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）的多基因同時敲除系統(tǒng)（inactivation of multiple genes in zygotes，IMGZ），并利用IMGZ系統(tǒng)構建Tet/Dnmt家族基因多種組合敲除的胚胎，探討早期胚胎發(fā)育中甲基化和去甲基化的作用，發(fā)現(xiàn)DNMT家族蛋白介導的DNA甲基化在小鼠原腸運動中的重要作用且不依賴于TET蛋白介導的DNA去甲基化的功能。進一步揭示Dnmt缺失胚胎中部分miRNAs啟動子區(qū)域甲基化的完全缺失導致miRNAs的表達劑量上調，部分參與導致的小鼠原腸運動失敗。

首先，為了實現(xiàn)在合子胚胎中高效的雙等位基因突變，研究在受精卵中比較了6個已報道的CBE系統(tǒng)（BE3，Gam-BE4，hA3A-BE3-Y130F，hA3A-eBE3-Y130F，X-BE3和X-BE4）靶向EGFP和Crygc基因后產(chǎn)生終止密碼子的能力，發(fā)現(xiàn)hA3A-eBE3-Y130F能高效地產(chǎn)生單個基因的純合敲除胚胎（>90%），且在胚胎中只產(chǎn)生低頻、隨機的SNVs脫靶現(xiàn)象（圖1）。接著建立了基于hA3A-eBE3-Y130F的IMGZ系統(tǒng)，以有效地產(chǎn)生Tet和Dnmt家族基因之間具有多個突變基因的胚胎。

圖1 篩選高效堿基編輯器并分析其脫靶效應

然后，研究人員利用IMGZ系統(tǒng)獲得了Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎，通過這些突變胚胎，發(fā)現(xiàn)Dnmt家族基因通過調節(jié)miRNA的劑量在胚胎原腸發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用。（圖2）

圖2 IMGZ介導的Dnmt1/3a/3b失活揭示了DNA甲基化在小鼠原腸胚形成中的關鍵作用

為了進一步探究TET蛋白介導的DNA去甲基化與DNMT介導的DNA甲基化在發(fā)育過程的作用，研究構建了Tet/Dnmt1-4KO、Tet/Dnmt3a/3b-5KO和Tet/Dnmt-6KO的胚胎。結果顯示這些胚胎發(fā)育的形態(tài)變化，甲基化及其分布，與Tet存在的Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎非常相似，表明TET家族蛋白對胚胎發(fā)育的調控不依賴與DNMT家族蛋白。(圖3)

圖3 DNA甲基化參與原腸形成，與DNA去甲基化無關

為了探究Dnmt-null影響胚胎原腸運動發(fā)生的分子機制，研究人員通過對Dnmt1-KO、Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null胚胎進行分別進行全基因組甲基化和轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相關基因啟動子具有高甲基化模式，而相關編碼基因表達基本不被甲基化缺失影響，但其中大量的miRNAs啟動子區(qū)域表現(xiàn)出高甲基化。

圖4 DNMT1、DNMT3A和DNMT3B共有的高甲基化啟動子與胚胎發(fā)育相關

最后，研究團隊利用微量小RNA測序系統(tǒng)（Cas9-assisted small RNA-sequencing，CAS-seq）鑒定這些胚胎中的miRNAs豐度。結果顯示Dnmt-null的胚胎中具有高甲基化啟動子的miRNAs表達都增加，大部分位于調控區(qū)域Dlk1-Dio3，表明了Dlk1-Dio3調控區(qū)域的DNA甲基化差異會影響miRNA的表達。而回補實驗則提示這些上調的miRNAs在抑制Dnmt-null胚胎發(fā)生原腸運動中具有重要作用。(圖5)

圖5 由DNA甲基化介導的miRNA表達抑制微調了原腸形成

綜上，該研究結果提供了體內證據(jù)支持DNA甲基化介導的精確的整體miRNA劑量參與了基因表達的微調，揭示了啟動子甲基化與抑制miRNA表達之間的表觀遺傳相關性，并證明IMGZ可以加速破譯體內多個基因的功能。

參考文獻：

1.Li, Q. et al. Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun 14, 2922 (2023).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38528-z