WGBS甲基化測(cè)序的應(yīng)用

　　WGBS被認(rèn)為是甲基化測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”。通過(guò)Bisulfite處理，將基因組中未甲基化的C堿轉(zhuǎn)換為U，根據(jù)PCR擴(kuò)增改為T(mén)，與原來(lái)進(jìn)行甲基化修飾的C堿區(qū)分開(kāi)來(lái)，結(jié)合高通測(cè)定順序技術(shù)與參考序列進(jìn)行比較，可以判斷CpG/CHG/CHH部位是否甲基化。特別適合繪制單堿基分辨率的全基因組DM。

　　應(yīng)用

　　利用全基因組甲基化測(cè)序繪制腫瘤微環(huán)境表觀特性譜。

　　WGBS研究背景

　　實(shí)體瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程包括腫瘤上皮細(xì)胞及其微環(huán)境之間的動(dòng)態(tài)相互作用。目前，對(duì)腫瘤的大部分表觀基因組研究都集中在上皮腫瘤細(xì)胞上。對(duì)維持腫瘤表型的腫瘤微環(huán)境的分子特性研究較少。腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞(CAF)是由腫瘤微環(huán)境構(gòu)成的主要細(xì)胞。CAF可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和增殖。CAF的表觀基因組特征譜還不清楚。

　　研究?jī)?nèi)容

　　利用文章WGBS技術(shù)對(duì)腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞CAF和非惡性前列腺纖維細(xì)胞NPF進(jìn)行甲基化，篩選兩者之間的差異甲基化區(qū)域DMR，并進(jìn)行DMR注釋。結(jié)果表明，CAF的DMR富集發(fā)生在基因調(diào)控領(lǐng)域，通過(guò)與RNAseq的聯(lián)合分析，證明了這些DMR對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用。另外，CAF的DMR基因注釋結(jié)果顯示DMR積累成了與腫瘤相關(guān)的信號(hào)途徑。CAF中篩選的這些DMR可用于前列腺癌診斷。

　　研究結(jié)果

　　1.對(duì)4例前列腺癌組織分離CAF、4例癌旁組織分離非惡性前列腺癌纖維細(xì)胞NPF分別進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序(WGBS)，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度超過(guò)7x。結(jié)果表明，NPF和CAF具有比較相似的甲基化譜。

　　2.比較NPF和CAF，兩組之間有7534個(gè)差異甲基化區(qū)域(DMR)，其中CAF有更多的低甲基化區(qū)域(5038個(gè))。

　　3.統(tǒng)計(jì)表明，CAF中確認(rèn)的DMR豐富地位于基因的調(diào)控區(qū)域，主要特征大多在CpG島地區(qū)之外。低甲基化DMR更多地位于子區(qū)域，更接近轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(TSS)。DMR在強(qiáng)化的子區(qū)域中豐富。

　　4.基因注解DMR，DMR的30%濃縮到腫瘤相關(guān)信號(hào)通路。5.為了進(jìn)一步研究調(diào)控區(qū)DMR的作用，利用RNAseq進(jìn)行了基因表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果顯示445個(gè)MDR與220個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)顯著相關(guān)，其中162個(gè)向上表達(dá)DEG相關(guān)的是低甲基化DMR。此外，可以通過(guò)BSP和RT-PCR確認(rèn)這種依賴(lài)關(guān)系。

　　6.通過(guò)比較前列腺癌上皮細(xì)胞和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌組織的甲基化數(shù)據(jù)，其中50個(gè)高甲基化DMR和15個(gè)低甲基化DMR可視為腫瘤特異性DMR，可用于前列腺癌診斷(AUC大于0.8)。